تراریختی ژنوم کلروپلاستی گیاه تنباکو (nicotiana tobaccum) با ناقل حاوی دو ژن انتخاب گر epsps جهش یافته و aada به طور هم زمان

فناوری گیاهان ترانسپلاستومیک جایگاه مهمی در مطالعات علوم پایه و زیست فناوری دارد. دست ورزی ژنتیکی ژنوم پلاستیدی به ویژه ژنوم کلروپلاست، مزایای متعددی نظیر بیان بالا، توانائی بیان ژن های چندگانه و عدم انتقال ناخواسته ژن خارجی توسط دانه گرده را فراهم نموده است. با توجه به این ویژگی ها، علاقه زیادی برای به کارگیری این سیستم ها جهت مصارف کشاورزی، صنعتی و پزشکی وجود دارد. یکی ازکاربرد های این فناوری متحمل سازی گیاهان با ارزش زراعی به علف کش ها یی نظیر گلایفوسیت است. گلایفوسیت از جمله علف کش های غیر انتخابی است که از طریق غیر فعال کردن آنزیم 5- انول پیروویل شیکیمات 3- فسفات سنتاز(epsps) در مسیر شیکیمات مانع سنتز اسیدهای آمینه حلقوی ودرنهایت موجب مرگ گیاه می گردد. از مطالعات پیشین، ژن دست ورزی شده epsps که در ساختار آن دو جهش ایجاد شده و به گلایفوسیت تحمل نشان می دهد، موجود می باشد. در این طرح از ماهیت پروکاریوتی کلروپلاست و توانایی آن در بیان mrna های پلی سیسترونی به منظور تولید هم زمان چند پروتئین نوترکیب استفاده شد. از طریق تعبیه ی توالی داخلی اتصال ریبوزوم (internal ribosome entry site,ires)، ژن epsps جهش یافته ی باکتریایی و متحمل به گلایفوسیت در ناقل کلروپلاستی pkcz و در کنار ژن aada (ژن مقاومت به آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین و استرپتومایسین) قرار گرفت. به این ترتیب یک ساختار اوپرونی و تحت کنترل پروموتر prrn16 ساخته شد.به منظور ارزیابی عملکرد mrna بلند حاصل در ترجمه پروتئین های مربوطه، دو سازه ژنی دی سیسترونیک تهیه شد. در یکی از سازه ها، ژن epsps در بالادست ژن aada همسانه سازی گردید و در دیگری در پایین دست آن قرار گرفت. تراریختی کلروپلاست ها با این دو سازه به روش زیست پرتابی و بر روی گیاه توتون انجام گرفت. به منظور دست یابی به گیاه تراریخت هموپلاسم، مراحل متعدد باززایی روی محیط انتخابی انجام شد. با آنالیزهای مولکولی بر روی گیاهان حاصل، حضور ژن های موجود در سازه در کلروپلاست این گیاهان مورد تأیید قرار گرفت. ارزیابی فنوتیپی گیاهان t0 با پاشیدن گلایفوسیت بر روی گیاهان تراریخت و گیاه تیپ وحشی به عنوان شاهد، انجام شد. نتایج حاصل، القا تحمل به علف کش تا سطح بیش از 0/2 میلی مولار را نشان داد که چهار برابر دوز کشنده برای نمونه غیر تراریخت است. برای به دست آوردن حد آستانه تحمل به گلایفوسیت در گیاه تراریخت لازم است غلظت های بالاتر علف کش بر روی گیاه اعمال گردد و تحمل گیاه ارزیابی شود.